Czy z jednego zdjęcia można dowiedzieć się wszystkiego o życiu zwierzęcia? Oczywiście, że nie. Podobnie jest w biologii samej komórki – piękny obraz utrwalonego preparatu pokazuje strukturę, ale nie zdradza dynamiki procesów zachodzących wewnątrz. Dlatego coraz większą rolę odgrywa analiza przyżyciowa, która pozwala obserwować komórki w ich naturalnym środowisku. Jakie są zalety i ograniczenia obu metod? Sprawdźmy.

Chyba każdy z nas widział kiedyś wypchanego lisa lub inne dzikie zwierzę w muzeum przyrodniczym. Podchodząc blisko, możemy w detalach przyjrzeć się sierści, pazurom, wąsom, a może nawet dotknąć okazałego ogona… I choć można rzec z uznaniem: „Ładny ten lis” — zaraz pojawia się refleksja: „Szkoda, że wypchany i nic więcej o nim nie wiadomo”. Ewentualnie zostaje zdjęcie, bo większość z nas nigdy nie zobaczy dzikiego lisa z tak bliska.

A skąd można się dowiedzieć o jego behawiorze, cyklu dobowym, czy żyje w parze, czy ma już może szczenięta? Biolodzy środowiskowi najczęściej pozyskują informacje z fotopułapek, czyli kamer aktywowanych ruchem, gdy zwierzę znajdzie się odpowiednio blisko. To właśnie takie urządzenia wnoszą najmniej ingerencji w życie dzikich zwierząt i pozwalają im się zachowywać naturalnie. Z fotopułapek nie dowiemy się, czy lis miał plamkę na sierści, nie zauważymy również czy miał ukruszony ząb, ponieważ obraz jest zwykle biało-czarny a większa część aktywności lisów toczy się nocą. Jednak będziemy w stanie zarejestrować ich zachowanie, monitorować liczebność, a nawet zdrowie populacji.

Ale co ten wywód o taksydermii i fotopułpakach ma wspólnego z metodami analiz we fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej? Wyobraźmy sobie, że chcemy uwidocznić struktury wewnątrzkomórkowe oraz ich lokalizację np. kompleksy białkowe w jądrze komórkowym. Standardowo stosowaną do tego metodą do jest immunofluorescencja, którą można porównać do taksydermii. Metoda polega na utrwalaniu komórek czynnikami chemicznymi (najczęściej aldehydami) oraz przerwaniem ciągłości błon przez permabilizację detergentem. Tak przygotowana próbka poddawana jest następnie barwieniu z użyciem swoistych przeciwciał, rozpoznających konkretne białka lub markery subkomórkowe i obrazowaniu we fluorescencyjnym mikroskopie konfokalnym, który pozwala na uzyskanie odpowiedniej rozdzielczości do obserwacji interesujących nas białek wewnątrz komórki. Podobnie jak wypchany lis, te komórki są jednak już nieżywe, statystyczne i można je obrazować, nie przejmując się w ogóle fototoksycznością. W takiej sytuacji możemy pozwolić sobie na „gęstsze” zbieranie obrazu w osi Z, podniesienie mocy lasera, wydłużenie czasu ekspozycji i manewrowanie do woli średnicą pinhola. Innymi słowy, tak jak przy pozowaniu z wypchanym lisem, mamy cały wachlarz ustawień parametrów obrazowania, które pozwolą na uzyskanie idealnego zdjęcia. Niestety nie uzyskamy żadnych informacji o dynamice procesów zachodzących wewnątrz komórek, czyli o tym co się działo z tą komórką bezpośrednio przed barwieniem immunoflorescencyjnym i jakie byłyby jej dalsze losy. Przykładowo nie otrzymamy odpowiedzi na pytanie, czy obecność kompleksów w jądrze jest skutkiem podziału komórki, który zaszedł bezpośrednio przez barwieniem. A może ich obecność w jądrze zainicjowała już któryś z mechanizmów śmierci komórki?

Sensownym w takiej sytuacji byłoby użycie ekwiwalentu fotopułapki, by obserwować komórki w warunkach, które nie zburzą homeostazy – czyli za pomocą analizy przyżyciowej (ang. live cell imaging). Analiza przyżyciowa jak sama nazwa wskazuje odbywa się „przy życiu komórek” i polega na zbieraniu obrazu komórek w czasie rzeczywistym. Narzędziem jest także fluorescencyjny mikroskop konfokalny. Tylko tym razem wyposażony w komorę przyżyciową, zapewniającą odpowiednią temperaturę, poziom CO₂ oraz wilgotność powietrza. Stosowane są również specjalne barwniki fluorescencyjne, które wnikają do wnętrza komórki bez przerywania ciągłości błony oraz białka fuzyjne – czyli takie, do których „przyłączamy” znacznik fluorescencyjny przy pomocy metod inżynierii genetycznej (np. GFP -ang. Green Fluorescent Protein). Absolutnie krytyczna dla efektywnej analizy przyżyciowej jest natomiast fototoksyczność, która doprowadza do stresu a czasami nawet do śmierci komórek. Wracając do naszej analogii, fotoksyczność jest jak obecność człowieka z kamerą w okolicach lisiej nory – taki lis ze stresu może tam już nie wrócić lub zachowywać się nienaturalnie.  Tak jak rozwiązaniem w tej sytuacji jest fotopułapka, która minimalizuje obecność człowieka w naturalnym habitacie lisów, tak samo przy live cell imaging minimalizujemy fototoksyczność, by zarejestrować najbardziej zbliżony do naturalnego obraz hodowli komórkowej. Aby przeprowadzić długie i informatywne obrazowanie, trzeba czasem ograniczyć jakość otrzymywanych zdjęć. Moc lasera oraz czas ekspozycji muszą być mocno zredukowane, siła sygnału powinna być wzmacniana w dużej części cyfrowo na etapie obróbki obrazu po eksperymencie, potrzebne są super-czułe detektory, które zarejestrują słaby sygnał, ograniczona do minimum liczba przekrojów w osi Z. Wreszcie obraz musi być zbierany na tyle często, żeby dostarczał informacji i na tyle rzadko, żeby nie „terroryzować” komórek światłem lasera. Efektem takiego eksperymentu nie są piękne, kolorowe, statyczne zdjęcia wypchanego lisa, ale film poklatkowy (ang. time-lapse), który pokazuje jego behawior czyli dynamikę procesów komórkowych. Dzięki live cell imaging otrzymamy odpowiedź na pytanie, jak lokalizacja badanego czynnika wpływa na zachowanie komórek – czy ich ruch nie jest zaburzony, czy nie jest to zdarzenie tuż przed śmiercią komórki, czy ma to wpływ na podziały komórkowe itp.

Czy to oznacza, że analiza przyżyciowa dostarcza obrazy płaskie, rozmazane i do tego ciemne? Nic bardziej mylnego! Większość z utrudnień można przezwyciężyć optymalizując parametry akwizycji obrazu. Poza mocą lasera, kluczowe są również ustawienia detektorów oraz skanera. Brzmi czasochłonnie? W większości systemów wyposażonych w standardowe detektory PMT (ang. PhotoMuliplier Tube), niestety tak jest. Natomiast już dziś na rynku dostępne są rozwiązania znacznie przyspieszające ten żmudny proces.

W standardowych detektorach PMT konieczne są ustawienia napięcie przechodzącego przez detektor (HV lub „Gain”), bramkowania („Gating”) czy opóźnienia między impulsem laserowym a momentem otwarcia bramki detektora („Offset”). Detektory krzemowe (SilViR, Evident) po prostu się włącza a reguluje się jedynie moc lasera. Dodatkowo są to detektory zoptymalizowane pod kątem zbierania pojedynczych fotonów, co przekłada się na detekcję nawet bardzo słabego sygnału fluorescencyjnego, a co za tym idzie można zmniejszyć moc lasera do absolutnego minimum (w praktyce mniej niż 1%).

Co do skanera, to są dwa do wyboru w standardowej mikroskopii konfokalnej– skaner galwanometryczny (zawsze) oraz rezonansowy (jako opcja, w systemie hybrydowym lub tandemowym). Najważniejsze różnice między nimi to prędkość skanowania oraz stosunek sygnału do szumu (ang. Signal-to-Noise Ratio, SNR). Jeśli chodzi o prędkość skanowania – wygrywa skaner rezonansowy i nie jest to mała różnica. W porównaniu do skanera galwanometrycznego przy rozdzielczości 512×512 pikseli ta prędkość może być nawet 30x szybsza, co czyni go dedykowanym do rejestracji bardzo dynamicznych procesów w żywych komórkach. Niestety szybkość ma swoją cenę, mianowicie wartość SNR, która jest dramatycznie niższa w porównaniu do skanera galwanometrycznego – 10x do 40x mniej fotonów na pojedynczy piksel obrazu. W celu poprawienia jakości uzyskanego obrazu, można manewrować ustawieniami akumulacji. A na czym polega akumulacja? Zamiast zbierać sygnał z „jednego przebiegu” detektora, system skanuje ten sam obszar wielokrotnie i sumuje wartości pikseli z kolejnych klatek lub linii przed wyświetleniem finalnego obrazu. Przykładowo w mikroskopie FV5000 (Evident), obrazowanie 244 przekrojów w osi Z z 4-krotną akumulacją zajmuje 4,6 min używając skanera rezonansowego, co przekłada się na 43,5 min dla skanera galwanometrycznego – bez straty w jakości obrazu.

Porównanie jakości obrazu uzyskanego za pomocą skanera galwanometrycznego oraz rezonansowego. Obrazowanie wykonane mikroskopem FV5000 (Evident). Skrawek mózgu myszy. Neurony piramidalne piątej warstwy kory mózgowej znakowane EYFP w linii Thy1‑YFP‑H. Zdjęcie udostepnione dzięki uprzejmości: dr Satoshi Fujimoto i dr Takeshi Imai, Graduate School of Medical Sciences, Uniwersytet Kyushu.”

Kolejnym rozwiązaniem specjalnie dedykowanym do analizy przyżyciowej jest mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem (ang. Spinning Disc). Po krótce, wirujący dysk to płytka z tysiącami otworów (pinholów), która kręci się z prędkością tysięcy obrotów na minutę. Dzięki temu preparat oświetlany jest w tysiącach miejsc naraz, zamiast skanować go punkt po punkcie jak w standardowym mikroskopie konfokalnym. W związku z tym czas ekspozycji każdego punktu próbki jest drastycznie krótszy, a energia dostarczona do komórki — znacznie mniejsza. Efekt? Wyraźnie obniżona fototoksyczność i możliwość szybszego obrazowania, co ma ogromne znaczenie przy rejestrowaniu dynamicznych procesów, takich jak podziały komórkowe, transport pęcherzyków czy nawet śledzenie pojedynczych cząstek wirusowych podczas infekcji komórek.

Immunofluorescencja. Komórki HeLa, niebieski: jądro komórkowe; zielony: tubulina; czerwony: B-katenina. Obiektyw 60x. Obrazowanie wykonane mikroskopem IXplore SpinSR (Evident). Zdjęcie wykonane przez: dr N. Derewońko, Helpi-Optics Sp. z o.o.

Czy w takim razie analiza przyżyciowa zastępuje preparaty utrwalone w mikroskopii konfokalnej? Absolutnie nie. Najważniejszymi przyczynami są tutaj ograniczenia w sposobach barwienia próbki oraz wymagania sprzętowe. Liczba dostępnych na rynku przeciwciał użytecznych w immunofluorescencji jest ogromna, co pozwala na wyznakowanie większości białek w komórkach ludzkich i zwierząt modelowych. Do tego również dochodzi szeroki wachlarz znaczników organelli komórkowych, które wnikają w określoną strukturę, idealnie ją uwidaczniając. Natomiast przy analizie przyżyciowej istnieją dość duże ograniczenia zarówno w sposobach barwienia jak i metodach inżynierii genetycznej. Kwiecistym przykładem jest błona komórkowa, gdzie jednym z najszerzej stosowanych markerów jest beta-katenina. Niemal u każdego producenta immunoglobulin znajdziemy swoiste wobec niej przeciwciała, natomiast nie ma możliwości wyznakowania jej przyżyciowo. Owszem istnieją takie barwniki przyżyciowe, które uwidaczniają błonę komórkową, ale niestety z czasem obserwacji internalizują do wnętrza komórki (np. Dil, DiO) lub mogą wywołać cytotoksyczność (np. WGA). Jak już wspominałam, gdy komórki są martwe, nie istnieje problem fototoksyczności. Stąd można w nie „wpakować” tyle barwników na ile pozwala liczba wiązek lasera i detektorów w mikroskopie, co daje piękne, kolorowe zdjęcia. Przy life imaging znów wskazane jest trzymanie się niezbędnego minimum, by nie obciążać próbki dodatkowym etapem naświetlania. W praktyce są to dwa lub maksymalnie trzy fluorochromy oraz światło przechodzące, które uwidacznia granice pojedynczych komórek. Istnieją też dość wyraźne restrykcje w konstrukcji białek fuzyjnych, gdyż białko fluorescencyjne (np. GFP ~27 kDa) może prowadzić do nieprawidłowego fałdowania białka znakowanego, stanowić zawadę przestrzenną do oddziaływania z innymi białkami, doprowadzać do agregacji i w konsekwencji utraty funkcjonalności.

Kolejnym aspektem w porównaniu tych dwóch metod są również wymagania sprzętowe. Tak jak do obserwacji wypchanego lisa potrzeba jedynie oczu, tak analizę w utrwalonych preparatach można przeprowadzić w każdym sprawnym fluorescencyjnym mikroskopie konfokalnym. Natomiast analiza przyżyciowa wymaga dodatkowego i niestandardowego sprzętu, który jest ekwiwalentem fotopułapki – komory przyżyciowej, czułych detektorów lub wirującego dysku dla obrazowania bardzo szybko zachodzących procesów wewnątrzkomórkowych.  

Zestawienie parametrów kluczowych w analizie przyżyciowej oraz w obrazowaniu preparatów utrwalonych preparatów utrwalonych.

Podsumowując, tak jak nikt nie wpadłby na pomysł, żeby oceniać zachowanie lisów po eksponacie muzealnym – tak samo nikt nie poszedłby do lasu na rozstawianie fotopułapek, tylko po to, żeby dowiedzieć się jak wygląda lis. Sztuka polega na wybraniu właściwej metody do danego pytania badawczego oraz możliwości sprzętowych i eksperymentalnych.

Jeśli chcecie dowiedzieć się, które rozwiązanie sprawdzi się najlepiej w Waszym laboratorium — zapraszamy do kontaktu! 😊

AUTOR: dr Natalia Derewońko, Specjalistka aplikacyjna ds. Mikroskopii Zaawansowanej

Dr Natalia Derewońko jest biolożką molekularną i doktorem nauk biologicznych. Stopień doktora uzyskała na Międzyuczelnianym Wydziale Biotechnologii UG/GUMed. Doświadczenie naukowe zdobywała w Laboratorium Biologii Molekularnej Wirusów, realizując projekty z patogenami klasy BSL2+, uczestnicząc w ośmiu grantach (NCN, NCBiR), kierując dwoma projektami oraz współtworząc sześć publikacji naukowych.

Przez kolejne lata rozwijała kompetencje na styku nauki i biznesu, wspierając sprzedaż, prowadząc szkolenia z biologii molekularnej oraz doradzając w doborze rozwiązań dla klientów akademickich i diagnostycznych. Obecnie pracuje jako specjalistka aplikacyjna ds. mikroskopii zaawansowanej w Helpi Optics Sp. z o.o., gdzie wspiera klientów w doborze systemów obrazowania i metod badawczych. Specjalizuje się m.in. w konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej, hodowlach komórkowych oraz analizie białek i kwasów nukleinowych.